Beim „Herkules Farnese“ handelt es sich um eines der eindrucksvollsten Männerbildnisse aus der Hand von Goltzius schlechthin. Zu sehen ist die mächtige Rückenansicht des Halbgottes, der auf seiner hochkant gestellten Keule lehnt, über der das Fell des nemeischen Löwen liegt. Herkules’ nackte Gestalt ist hochaufragend und muskulös. In der Hand hinter seinem Rücken hält er die drei sagenumwobenen „Äpfel der Hesperiden“, seine elfte der insgesamt zwölf legendären Aufgaben für den mykenischen König Eurystheus.

Diese Äpfel, die im Garten der Hesperiden wuchsen und bewacht waren, schenkten den Göttern ewiges Leben. Herkules, der den Garten nicht betreten durfte, entsendete Atlas, der in einigen Überlieferungen als der Vater der Hesperiden galt. Dafür übernahm Herkules kurzzeitig seine Himmelslast. Als er mit den Äpfeln zurückkehrte, war Atlas froh, die Last nicht mehr schultern zu müssen und verweigerte ihre Rücknahme. Der listige Herkules tat so, als wolle er sich mit der neuen Aufgabe begnügen, bat Atlas jedoch scheinheilig, die Last nur kurz zu übernehmen, damit er sich eine Nackenstütze holen könne. Atlas willigte ein und übernahm das Himmelsgewölbe erneut. Herkules, welcher nicht vorhatte, das Gewicht zurückzunehmen, griff sich die Äpfel und ging.

Goltzius skizzierte die kolossale Statue im Innenhof des Palazzo Farnese in Rom, wo sie unter einer Arkade stand. Es existieren drei Zeichnungen von beiden Seiten des Herkules Farnese, von vorne als auch von hinten, die sich heute im Teylers Museum in Haarlem befinden. Beim Rückenakt nutzte Goltzius effektvoll das Gegenlicht, in das er blickte. Im Gegensatz zur Zeichnung weist der Kupferstich einen fiktiven Wolkenhimmel auf, der Raum suggeriert und Herkules’ mächtiger Gestalt zusätzliche Monumentalität verleiht.

Dazu dienen auch die beiden kleinen Köpfe der Zuschauer in der rechten unteren Bildecke, deren Identität ungeklärt ist. Eine separate, ihnen gewidmete Zeichnung befindet sich heute im Museum Fodor in Amsterdam. Ihre Anwesenheit veranschaulicht, dass der Darstellung eine wirkliche Anschauung zugrunde liegt – und sie nicht etwa aus älteren Studienbüchern entnommen wurde. Mit ihnen verleiht Goltzius der Darstellung eine geschickte, erzählerische Note: Die beiden Beobachter sehen den eigentlichen Bildinhalt – die Äpfel der Hesperiden – nicht, dafür müssten sie um die Skulptur herumlaufen. Der Betrachter, der sie sieht, verbleibt jedoch im Ungewissen über ihre Vorderseite.

Seine angeschlagene Gesundheit und vor allem seine überbordende Neugierde in Hinblick auf das Studium antiker Bildwerke bildeten für Goltzius die ausschlaggebenden Gründe, um 1590/91 eine beschwerliche Reise nach Italien anzutreten. Bei van Mander ist nachzulesen: „Als er nun sah, dass sein Leben … an einem seidenen Faden hing, und er keinen Arzt fand, der die Zuversicht hatte ihm zu helfen, einer wie der andre vielmehr sagte, dass es schon zu weit mit ihm gekommen sei, fasste er schließlich den Entschluss, obgleich er sich schwach fühlte, nach Italien zu reisen, wo er Besserung seines Zustands erwartete oder doch wenigstens die Schönheit der italienischen Kunst vor seinem Tode zu sehen hoffte“.

Einen nicht unerheblichen Grund dürfte auch die Tatsache gespielt haben, dass sich Goltzius dadurch auf die Pfade des von ihm hoch verehrten Albrecht Dürer begeben durfte, der 1494/95 und 1504/05 in Venedig gewesen ist. Überhaupt entsprach es gängiger Tradition für niederländische Künstler, nach Italien zu reisen, wie dies etwa bei Jan Gossaert 1508/09 oder Maarten van Heemskerck 1532/35 der Fall war. Den Überlieferungen seines Freundes Karel van Mander zufolge reiste Goltzius inkognito, unter dem Namen „Hendrick van Bracht“, und kleidete sich, um nicht erkannt zu werden, absichtlich „bäurisch auf deutsche Art“. Über Amsterdam reiste er nach Hamburg. Die Reise durch Deutschland unternahm er zu Fuß oder mit dem Pferd. Um ungestört zu bleiben, gab er sich als sein Gehilfe aus, der ihn begleitete. Als er den Kupferstecher
Johannes Sadeler in München traf, machte er sich einen Spass mit ihm (weshalb er ihm später – sozusagen als Wiedergutmachung – das Blatt „Kalliope“ aus seinen „neun Musen“ widmete) und ließ diesen seinen Gehilfen, von dem er dachte, dass er er selbst sei, nach Hause zum Essen einladen. Er selbst stellte sich ihm als holländischer Käsehändler vor, der versprach, seiner Frau Käse zu senden. Er reiste über den Brenner und kam mit Zwischenstationen in Verona, Bologna und Florenz Anfang 1591 in Rom an.

Im April 1591 reiste er mit zwei Begleitern nach Neapel, mit dem Brauer und Silberschmied Jan Matthijsz. Ban und dem Brüsseler Jesuiten und Kunstliebhaber Philips van Winghen (1560 – 1592). Im Sommer 1591 kehrte er nach Rom zurück, wo er sich schließlich doch noch Gelehrten und Künstlern zu erkennen gab. Im August 1591 reiste er über Bologna, Florenz und Venedig wieder zurück. In München gab er sich bei einem zweiten Treffen selbst Sadeler zu erkennen.