Ein außergewöhnliches Format hat dieser aus acht Druckplatten zusammengesetzte friesförmige Stich mit der Geschichte der antik-mythischen Königin Niobe. Die Bilderfolge geht auf ein Fresko des italienischen Malers Polidoro da Caravaggio (um 1499–1543) zurück, das Goltzius während seiner Zeit in Rom abzeichnete und dann zuhause von Jan Saenredam in Kupfer stechen ließ. Womöglich aufgrund der komplizierten Komposition wurde – entgegen der sonstigen Gepflogenheiten in Goltzius’ Betrieb – in diesem Fall das Vorbild spiegelbildlich umgesetzt, so dass sich der Bildsinn gegen die Leserichtung von rechts nach links entwickelt.

Nun strömen also von der rechten Seite die Einwohner Thebens herbei, um dem Kultbild der Latona, das im Zentrum auf einem reich geschmückten Sockel dargestellt ist, ihre Opfergaben darzubringen. Ihnen stellt sich mit herrischer Geste Niobe, die Königin von Theben entgegen: Nicht die Titanin Latona solle verehrt werden, sondern sie selbst, habe sie doch die höhere Abstammung und mehr Kinder zur Welt gebracht als diese. Links neben der Verehrungsszene sieht man, wie sich die gekränkte Latona an ihre beiden Kinder Apollon und Diana wendet, die sogleich zur Vergeltung aufbrechen, wie im linken Teil des Frieses zu sehen ist, wo sie die Söhne und Töchter der Niobe mit ihren tödlichen Pfeilen verfolgen. Ganz links am Bildrand sitzt schließlich die vor Gram erstarrte Niobe, eine sterbende Tochter im Schoß.

Wie bei einem Relief entwickelt sich das Bild nicht in den Tiefenraum hinein, sondern entfaltet sich in der Fläche. Beeindruckend ist vor allem, wie die Figuren durch ihre Körper und Blicke aufeinander bezogen sind und so die Augen des Betrachters über die extrem langgestreckte Komposition führen. Dabei wird die gesamte Darstellung durch das Abwechseln von hellen und dunklen Partien rhythmisch strukturiert.

Reste des originalen, von Polidoro und seinem Mitarbeiter Maturino da Firenze (1490–1528) gemeinsam geschaffenen Niobe-Frieses befinden sich noch heute in situ an der Fassade des Palazzo Milesi in der Via della Maschera d’Oro in Rom. In den 1520er Jahren hatte Polidoro zahlreiche Fassaden mit seinen virtuosen, monochrom in Schwarz-Weiß gemalten Fresken ausgestaltet. Allerdings setzte die Witterung diesen so übel zu, dass bereits in den 1570er Jahren Karel van Mander den Verfall der von ihm hochgelobten Werke feststellen musste. Der Kunstkritiker bewunderte die Fülle der Details mit Waffen, Schlachten und Triumphzügen und sah darin beispielhaft die Kunst der Antike repräsentiert. Sowohl bei der Gestaltung der Figuren als auch bei der Organisation des Bildraums ist deutlich der Einfluss antiker Friese und Reliefs spürbar, die Polidoro und Maturino eingehend studiert hatten. Der Niederländer erwähnt auch Polidoros Niobe-Fresko und dass es Goltzius zum Nachzeichnen „verlockt“ habe.

Die Werke Polidoros scheinen für Goltzius besonders lohnende Vorbilder abgegeben zu haben. Von anderen römischen Fassaden zeichnete er eine Folge von acht Göttern sowie drei mythologische Szenen ab, um sie später in Kupferstiche zu übertragen. Vermutlich war es Polidoros große Nähe zur antiken Kunst, die ihn besonders reizte und die den Renaissancemaler wie ein den antiken Künstlern ebenbürtiges Vorbild erscheinen ließ. Die monochrome Ausführung der Wandmalereien in subtil abgestuften Grautönen könnte ein weiterer Anreiz für Goltzius gewesen sein, die Kompositionen in das Schwarz-Weiß eines Kupferstichs zu übersetzen.

Die prominent in der unteren Mitte angebrachte Widmung richtet sich an Federico Cesi, Herzog von Aquasparta, den man bisher mit Federico Cesi II. (1585–1630), dem bekannten Naturwissenschaftler und Gründer der Academia dei Lincei (Akademie der Lüchse = der Scharfsinnigen) identifiziert hat. Eine solche Identifikation ist in der Tat verlockend, war Goltzius doch selbst an naturwissenschaftlichen Fragen interessiert. Cesi war 1594, als der Stich entstand, jedoch gerade einmal neun Jahre alt – dass er einmal ein bekannter Wissenschaftlicher werden würde, war zu diesem frühen Zeitpunkt wohl noch nicht abzusehen. So liegt es näher, seinen gleichnamigen, heute weniger bekannten Vater Federico Cesi I. als Adressaten der Widmung zu sehen, auch wenn dieser eher durch Prunk und Zerstreuung von sich reden machte. Die Cesi mit ihren großen Besitzungen in Umbrien zählten zu den bedeutendsten Familien Roms zu dieser Zeit und waren mit hohen kirchlichen Ämtern betraut. Seit 1567 residierten sie im ehemaligen Palazzo Gaddi in der Via della Maschera, genau gegenüber des Palazzo Milesi. Auch ihre Fassade schmückte ein komplexes, von antiken Darstellungen inspiriertes Bildprogramm in monochromer Malerei aus der Hand Polidoros. Goltzius’ Stich zeigt also genau die Ansicht, die man vom Palazzo der Familie Cesi aus auf die gegenüberliegende Straße hatte.